Skip to Content

Протеомика

 

Нашей лабораторией ведется исследование белков клеточных стенок растительных клеток методами протеомики. Особое внимание в наших исследованиях уделено вторичной клеточной стенке желатинозного типа, которую формируют исключительно растительные волокна, и сравнительному анализу протеома вторичной клеточной стенки ксиланового и желатинозного типа. В качестве модельных систем нами выбраны растения, ткани которых формируют клеточные стенки и ксиланового типа и желатинозного. Такими модельными системами служат растения льна-долгунца (Linum usitatissimum L.) и конопли (Cannabis sativa L.), в которых клетки ксилемы формируют вторичную клеточную стенку ксиланового типа, а флоэмные волокна – вторичную клеточную стенку желатинозного типа. Это позволяет сравнивать белки, характерные для того или иного типа клеточных стенок, сформированных в одних и тех же условиях окружающей среды, на одной стадии развития растения.

Протеомика клеточных стенок столкнулась с рядом трудностей, связанных как с самой структурой клеточных стенок, так и с природой клеточно-стеночных белков, что усложнило процедуру их экстракции, разделения и дальнейшей идентификации. Клеточная стенки не окружена мембраной, как большинство других субклеточных компартментов, что делает особенно вероятными и потери белков, и попадание во фракцию чужеродных полипептидов. Особенно это касается щелочных белков, которые могут ионно взаимодействовать с уроновыми кислотами пектиновых веществ. Именно такое взаимодействие характерно для многих канонических белков клеточной стенки: из них более 60% имеют pI в диапазоне от 8.0 до 12.9 (Jamet et al., 2006). Таким образом, необходимо тщательно отрабатывать методы выделения клеточной стенки, использовать адекватные контроли и альтернативные подходы для локализации белка. Тем не менее, несмотря на трудности, протеомика клеточных стенок стала активно развивающимся направлением в современной клеточной биологии (Boudart et al., 2007).

Протеомика растительных клеточных стенок, также как и протеомика любых других белков, включает три основных этапа:
  1. экстракция белков клеточной стенки;
  2. разделение клеточно-стеночных белков с помощью одномерного / двумерного электрофореза или жидкостной хроматографии;
  3. идентификация индивидуальных белков путем анализа масс-спектров фрагментов, полученных в результате частичного гидролиза.

1. Экстракция белков клеточной стенки.

Наиболее оригинальная часть связана с разработкой метода выделения изолированных флоэмных волокон льна и последующей экстракцией из них белков клеточной стенки. Флоэмные волокна льна (Linum usitatissimum L.) являются уникальной моделью для установления общих закономерностей биогенеза растительной клетки с использованием разноплановых подходов, в том числе функциональной геномики и протеомики. Волокно как модельная система позволяет избежать ряд трудностей, связанных с гетерогенностью растительного образца. Так, на стадии формирования вторичной клеточной стенки волокна можно отделить от окружающих тканей с помощью отмывки в этаноле после лиофилизации (рис. 1). Это дает возможность изучения протеома определенного типа клеток на определенной стадии их развития, а также и отдельных субклеточных структур. Расположенные вдоль всего стебля волокна собраны в пучки, что облегчает их обнаружение и выделение, делая возможным проведение исследований на уровне однотипных клеток.

Рис. 1. Получение изолированного волокна.

Обособленность отдельных стадий биогенеза волокна, а также наличие так называемой «точки слома» – морфологического индикатора перехода волокон от удлинения клетки к утолщению стенки, позволяют изучать специфичные для стадий процессы. Уникальность флоэмного волокна льна проявляется также в слабой лигнификации вторичной клеточной стенки, что облегчает экстракцию составляющих ее полимеров. Чтобы получить волокна, активно формирующие вторичную клеточную стенку, участки стебля ниже «точки слома» разделяли на флоэмную и ксилемную части. На этом участке стебля волокна имеют толстую вторичную клеточную стенку, пучки волокон легко отделяются со слоем коровой паренхимы и эпидермисом, причем разделение происходит по внутренней стороне пучка. Эпидермис и большая часть паренхимных клеток удаляется при тщательном отмывании ткани.

В нашей работе исследовались экстрагируемые солями белки, которые относятся к слабо связанным белкам клеточной стенки. Выделение клеточной стенки и экстракцию белков проводили согласно протоколу, разработанному Л. Фейз с соавторами (Feiz et al., 2006), с некоторыми модификациями. Схема эксперимента: изолированные волокна тщательно размельчали в жидком азоте. Далее проводили:

  1. гомогенизацию и последовательное центрифугирование в растворах с высокой плотностью сахарозы (0.4 М, 0.6 М и 1.0 М) в 5 мМ ацетатном буфере, рН 4.6;
  2. интенсивную отмывку осадка 5 мМ ацетатном буфером, рН 4.6 (не менее 2 л на 8 г сырой ткани);
  3. Белки экстрагировали последовательно 0.2 М CaCl2 и 2.0 М LiCl (в 5 мМ ацетатном буфере, рН 4.6 с добавлением коктейля ингибиторов протеиназ (Sigma, США));
  4. Полученный супернатант обессоливали на G-25 (15 х 50 мм, GE Health Care, Sweden, Supelco, USA);
  5. Белки осаждали 80% ацетоном в течение ночи при -20ºC.

2. Разделение клеточно-стеночных белков. Для разделения белков использовали одномерный электрофорез (1D-электрофорез), т.к., согласно данным литературы, технология двумерного электрофореза менее эффективна для разделения белков клеточной стенки. Причем более обогащена белками фракция, экстрагируемая 0.2 М CaCl2, именно эта соль считается самой эффективной для извлечения клеточно-стеночных белков из высших растений (рис. 2).

Рис. 2. Электрофореграмма клеточно-стеночных белков ксилемной части стебля льна и флоэмных волокон, экстрагируемые солями.

3. Идентификация индивидуальных белков путем анализа масс-спектров фрагментов, полученных в результате частичного гидролиза Для трипсинолиза с последующим получением масс-спектров (на базе Центра Коллективного Пользования ИБМХ) вырезали из геля белковые полосы. В каждом образце присутствовали пептиды нескольких белков, что делало получаемый спектр более сложным и, вероятно, отразилось на эффективности идентификации. Полученные для всех образцов пептидные спектры помещали в поисковую программу Mascot. Для идентификации белков по поиску гомологичных пептидных масс (Peptide Mass FingerPrint) отбирали только качественные спектры: учитывали наличие трипсиновых фрагментов, количество пептидов и интенсивность сигналов. Для идентификации белков использовали базу данных NCBInr и SwissProt. Для установления принадлежности обнаруженного белка к клеточной стенке аминокислотную последовательность (из базы данных NCBInr и Swissprot), проверяли на наличие сигнального пептида, ответственного за экстраклеточный транспорт, с помощью программ TargetP и SignalP (www.cbs.dtu.dk/services/TargetP, www.cbs.dtu.dk/services/SignalP), а также Phobius (http://phobius.sbc.su.se/), PS-Scan (http://expasy.org/prosite). Для установления субклеточной локализации белка помимо TargetP использовали также программы Psort (http://wolfpsort.org/), Predotar (http://urgi.versailles.inra.fr/predotar/predotar.html). Те белки, которые согласно этим программам были идентифицированы как экстраклеточные, дополнительно проверяли на наличие трансмемебранного домена с помощью программы TMHMM (www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM) , а также концевых последовательностей аминокислот KDEL и HDEL, ответственных за удержание белка в эндомембранной системе. Принадлежность к неклассическим белкам внеклеточного матрикса устанавливали при помощи программы SecretomeP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SecretomeP-1.0).

С помощью целого комплекса подходов, включая методы протеомики, нами был охарактеризован индивидуальный белок клеточной стенки – бета-галактозидаза; для характеристики использовали методы хроматографии, электрофорез, электроэлюцию, иммуноферментный анализ, иммуноцитохимию, ПЦР в реальном времени, масс-спектрометрию. Это позволило в полной мере охарактеризовать белок, выявить его активность, выявить и оценить экспрессию гена данного белка, обнаружить продукты реакции исследуемого фермента:

Roach M.J., Mokshina N.Y., Snegireva A.V., Hobson N., Deyholos M.K., Gorshkova T.A. Development of Cellulosic Secondary Walls in Flax Fibers Requires beta-Galactosidase // Plant Physiology. 2011. V.156. P. 1351-1363.

Мокшина Н.Е., Ибрагимова Н.Н., Сальников В.В., Аменицкий С.И., Горшкова Т.А. Галактозидаза растительных волокон с клеточной стенкой желатинозного типа: идентификация и локализация // Физиология растений. 2012. Т.59. №2 (в печати).